BIOMATERIAIS INJETÁVEIS DE COLÁGENO BOVINO PARA CORREÇÕES PLÁSTICAS EM GERAL

INJECTABLE BIOMATERIALS OF BOVINE COLLAGEN FOR PLASTIC CORRECTION IN GENERAL

Por Márcio de Paula

CORRESPONDING AUTHOR:
Dr. Márcio de Paula
e-mail address: marcio@iqsc.usp.br

Márcio de Paula: químico, formado pela Universidade de São Paulo (IQSC/USP), doutor em química analítica (ênfase em biomateriais) pelo Instituto de Química de São Carlos (IQSC/USP) e pesquisador de desenvolvimento tecnológico industrial pela Proline Biomédica Ltda. Em sua tese de doutorado enfatizou o desenvolvimento e a caracterização de compósitos de colágeno aniônico:ramsana como biomateriais injetáveis para correções plásticas em geral.

OBS: Não há conflitos de interesse na referida publicação.

Resumo
O colágeno em função de suas propriedades naturais que incluem baixa alergenicidade, antigenicidade e biocompatibilidade elevada, tem se tornado uma fonte primária para a fabricação de biomateriais sob as mais variadas formas. Diferentes formulações de colágeno (por exemplo filmes e esponjas) tem sido desenvolvido recentemente para vários dispositivos biomédicos que miram necessidades clínicas específicas. Em busca de procedimentos cirúrgicos minimamente invasivos, um foco maior tem sido deslocado para formulações injetáveis, principalmente àquelas voltadas para preenchimento de defeitos de tecidos moles. Tal prática tem-se tornado de modo crescente muito importante, pelo fato de muitos indivíduos estar procurando um melhoramento estético sem maiores procedimentos cirúrgicos. Este artigo discute as aplicações das formulações injetáveis de colágeno bovino encontradas comercialmente, bem como as suas características físicas e químicas.
PALAVRAS-CHAVE: Colágeno; Envelhecimento da Pele; Materiais Biocompatíveis; Polissacarídeos Bacterianos.

ABSTRACT
Considering the natural properties of collagen, which include low allergenicity, antigenicity and raised biocompatibility, it has been primary source to be used as raw material in the production of biomaterials in various ways. Different formulations of collagen (e.g. collagen films and sponges) have been developed in recent years for various biomedical devices targeting specific clinical needs. With the shift toward minimally invasive surgical procedures, more focus has been placed on injectable implants, mainly the those returned to the soft tissue augmentation. Such a practice has been turning a very important growing way, for the many individuals, fact be seeking an aesthetic improvement without larger surgical procedures. This article review applications of the formulations bovine collagen injectable found commercially, as well as the physical and chemical characteristics.
KEYWORDS: Collagen; Biocompatible Materials; Polysaccharides, Bacterial; Skin Aging.

I. Introdução
A manutenção de um semblante jovem é bem estabelecida pela sociedade moderna. A juventude é comparada com vitalidade, fecundidade e acima de tudo atratividade; disfarçar a passagem do tempo estampada na face não é um fenômeno novo, embora a proporção das pessoas que vivem até velhice seja. De fato, recentes estimativas sugerem que o número de pessoas com 65 anos ou mais nos Estados Unidos aumente de 12,4% da população total em 2000 à 19,6% em 20301. Já no Brasil segundo o IPEA2, a expectativa de vida subiu para 77,3 anos para os homens e 86,1 anos para as mulheres. Unindo esta tendência demográfica para expectativas ascendentes contra o envelhecimento, diferentes alternativas tem contribuído com a medicina e a tecnologia para rejuvenescer a face em processo de envelhecimento3. Com isso, as terapias para o aumento de tecido mole, viu nos últimos anos um interesse crescente do número de pacientes em busca da melhoria estética, registrando um aumento de 444% desde 1997 segundo a da Sociedade Americana para Cirurgia Plástica e Estética4 (Gráfico 1), incluindo procedimentos cosméticos cirúrgicos e não cirúrgicos. Dentro destes procedimentos, encontram-se as aplicações das formulações colágeno de origem bovina.
A dificuldade no desenvolvimento bem sucedido de um biomaterial, ressalta a complexa interação entre o corpo e algum implante5. Materiais que inicialmente parecem ser apropriados e bem sucedidos, comumente falham para permanecerem integrado com os tecidos vizinhos ou são degradados com o passar do tempo. Dentre essas dificuldades, as formulações injetáveis de colágeno bovino tem-se mostrado ser altamente biocompatível e eficiente na produção adequada da elevação e persistência do seu volume, em função do crescimento tecidual6. Por outro lado, em virtude da deficiência de colágeno em uma pele envelhecida, fez com que este se tornasse um agente preenchedor cutâneo muito popular desde as primeiras aplicações e a cada ano que passa, tem conquistado grande interesse e aceitação das pessoas em todo mundo4.

Gráfico 1. Tendências em cirurgias cosméticas: Total de procedimentos cirúrgicos e não cirúrgicos. Fonte: THE AMERICAN SOCIETY FOR AESTHETIC PLASTIC SURGERY (ASAPS)4.

I.1. Colágeno como biomaterial

O colágeno é a proteína mais abundante do reino animal, com duas características importantes que o credenciam como biomaterial: a) baixo índice de alergenicidade (cerca de 2% para colágeno heterólogo) que pode ser reduzido mais ainda pela remoção dos telopeptídeos N e C-terminais, tornando-o altamente biocompatível; b) as preparações solúveis ou fibrilares de colágeno são capazes de reconstituir-se, isto é, organizar-se estruturalmente da mesma forma que o tecido nativo com propriedades similares7. Devido as suas várias propriedades físico-químicas (susceptíbilidade de ser modificado quimicamente sem perder suas propriedades básicas, controle do grau de embebição via ligações cruzadas); Físico-mecânicas (entrelaçamento ou orientação das fibras, resistência e elasticidade) e biológicas (antigenicidade mínima, reduzida por tratamento com enzimas ou por reticulação); o colágeno é largamente utilizado como material para implante, tanto na sua forma pura como em géis de colágeno8, ou ainda associado a outras moléculas, como polissacarídeos biológicos e microbianos9.

I.1.1. Características estruturais do colágeno

O colágeno é a principal proteína estrutural dos tecidos dos vertebrados, correspondendo de 5 a 33% da proteína total e por conseguinte, a 6% em peso do corpo humano7. Ele é responsável pela modulação das forças externas e internas exercidas dentro do organismo. As diferentes propriedades destes tecidos são em parte devido ao resultado de diferentes organizações das fibras de colágeno. Sua principal característica é a formação de fibras insolúveis com grande resistência à tração10. Além de seu papel estrutural nos tecidos, o colágeno possui também outras características, tais como, a função de orientar os tecidos em desenvolvimento11 que é altamente compatível na sua utilização como biomaterial.
De acordo com a estrutura primária das cadeias a que o constituem, hoje são conhecidos 19 tipos de colágeno quimicamente distintos11, cuja localização depende do tecido. Dentre eles se encontra o colágeno do tipo I, o mais abundante do tecido conjuntivo, correspondendo de 80 à 85% da matrix dermal da pele de um adulto12. Este é considerado como sendo de fácil obtenção, podendo ser encontrado na pele, tendões, ossos, submucosa intestinal porcina, vasos sanguíneos, cartilagem, córnea e também na estrutura e nos interstícios de todos os outros tecidos e órgãos com exceção do sangue, linfa e tecidos queratinosos7.

1.2. Colágeno tipo I

O colágeno tipo I tem como unidade básica o tropocolágeno (Figura 1b), uma macromolécula linear, semiflexível cuja massa molecular média é de aproximadamente 280.000 Da10, e com dimensões de 300nm de comprimento e 1,5nm de diâmetro. O tropocolágeno é formado por três cadeias polipeptídicas denominadas de cadeias a do mesmo tamanho (Figura 1b), sendo duas iguais (a1) e uma diferenciada (a2). Essas cadeias entrelaçam-se entre si formando uma hélice tripla em forma de um bastonete (Figura 1c)10,13,14, onde cada uma contém 1055 e 1029 resíduos de aminoácidos, respectivamente. A seqüência desses resíduos de aminoácidos é notavelmente regular, e apresentam-se na forma de unidades repetitivas, denominada tripletes do tipo (-Gly-X-Pro-)n ou (-Gly-X-Hypro-)n, onde X é um aminoácido qualquer que é essencial para a organização do colágeno em fibras7,10
(Figura 1a). Esta seqüência de resíduos, resulta em uma proteína com um conteúdo de glicina (Gly) de 33%, prolina (Pro) 12% e hidroxiprolina (Hyp) 11%, cuja estrutura na forma de hélice tripla é estabilizada por ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas. O tropocolágeno apresenta uma região helicoidal e extremidades não helicoidais, denominadas de telopeptídeos N e C-terminais, que possuem respectivamente 16 e 25 resíduos de aminoácidos 10,13,14. Estes telopeptídeos são os sítios para o estabelecimento de ligações cruzadas covalentes intermoleculares.

Nos tecidos, o colágeno organiza-se em estruturas fibrilares que são estabilizadas por ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Esta organização fibrilar tem origem na microfibrila, cujo modelo mais aceito é o de Smith14 (Figura 1d). Neste modelo, as moléculas de tropocolágeno estão deslocadas um quarto em relação à molécula adjacente, apresentando também uma região de espaçamento vazio entre duas moléculas alinhadas longitudinalmente (“gap”), seguidas de uma região de sobreposição (“overlap”) destas moléculas (Figura 1d).

I.1.3. Colágeno aniônico

Modificações químicas em matrizes colagênicas15,16 constituem-se em alternativas de elevado potencial para melhorar ou modificar as propriedades do colágeno, sejam elas mecânicas, estruturais ou físico-químicas. Nesse aspecto, a adição de cargas sobre matrizes colagênicas modifica a energia de superfície17, resultando em uma melhor interação com o tecido atendendo então, as necessidades específicas da área de biomateriais.
Matrizes colagênicas com superfícies carregadas podem ser produzidas por reações químicas como a esterificação18, succinilação19, deaminação20 e com o glutaraldeído18 (Figura 2).

Figura 2 - Representação esquemática de reações com colágeno: (a) esterificação, (b) succinilação, (c) reticulação com glutaraldeído.

Um outro processo para a preparação de materiais de colágeno carregados negativamente a pH 7,4 é a hidrólise seletiva dos grupos carboxiamidas dos resíduos de aminoácidos asparagina (Asn) e glutamina (Gln) presentes nas cadeias a do colágeno tipo I21 (Figura 3). Esta modificação conduz a um aumento total de até 106 cargas negativas22 por unidade de tropocolágeno após tratamento alcalino de 72 horas (Gráfico 2).

Figura 3. Esquema da hidrólise dos resíduos de glutamina e asparagina presentes no colágeno em meio alcalino.

Como resultado, tem observado que a reação de hidrólise promove alterações no padrão da organização da estrutura microfibrilar da matriz colagênica, que estão relacionadas com o rompimento das ligações cruzadas do tecido e também com o novo padrão de interações eletrostáticas, que ocorre em função do aumento de cargas negativas da matriz22. Este aumento inibe significativamente a habilidade de moléculas de colágeno em formar fibrilas, tendo uma completa inibição após
72 horas de hidrólise (Gráfico 2). Este fato é extremamente importante na obtenção do colágeno injetável, pois desta forma evitará o problema de precipitação de fibras durante a extrusão que é comumente encontrado com algumas preparações comerciais.
Outra vantagem é sua facilidade de obtenção, baixo custo e principalmente pelo fato de ser um tecido natural proveniente de diversas fontes, tais como tendões, serosa, pericárdio entre outras, que estão facilmente disponíveis no mercado.

Gráfico 2. Hidrólise seletiva de grupos carboxiamidas dos resíduos de asparaginas e glutaminas presentes no pericárdio bovino22.

I.2. Géis injetáveis de colágeno

Uma substância é eficiente na guerra para corrigir deformidades em tecidos moles quando produz um efeito compatível, com o mínimo possível de reações23. O ideal é utilizar materiais em que a probabilidade de efeitos colaterais sejam pequenas, pois as técnicas de implante variam de médico para médico. Outras dicas importantes para o implante, são que o produto escolhido deve ser biodegradável e de fácil acesso, ter efeitos previsíveis e durar algum tempo quando implantado com a técnica correta. Por fim, deve-se dar preferência a um produto que tenha a aprovação de órgãos compatíveis de cada país e que também apresentem baixo custo.
Desta maneira, os géis injetáveis de colágeno foram introduzidos com o intuito de minimizar os riscos para os pacientes, possibilitar a repetição do procedimento em caso de falha e não reduzir as opções futuras de tratamento, coisas que não aconteciam com os biomateriais sintéticos24. Estes géis uma vez implantado, deve produzir adequada elevação e persistência do seu volume, possuir elasticidade suficiente para não causar obstrução e não provocar reações biológicas indesejáveis23. Em outras palavras, a substância injetada deve ser substituída por material endógeno, ocorrendo processo cicatricial controlado. Estas foram algumas das justificativas para o desenvolvimento dos géis de colágeno para correções plásticas em geral25, tratamento de incontinência urinária26, e aumento de volume de cordas vocais27.
Atualmente, o gel injetável de colágeno bovino tem sido um dos produtos mais utilizados para técnicas de preenchimento e correções de defeitos de tecidos moles4. O primeiro passo em direção ao desenvolvimentos deste material tornou-se popular em 1958 quando foi observado que em condições fisiológicas, um gel sólido poderia ser produzido através de um aquecimento brando da solução de colágeno até a temperatura do corpo28. Em 1960, foi descoberto que a remoção seletiva dos telopeptídeos amino e carboxi terminais não helicoidais reduziriam significativamente a antigenicidade da molécula de colágeno29.
Com alternativa a alguns biomateriais sintéticos (parafina, silicone, pasta de teflon, etc) e para a satisfação daqueles que tinham problemas a corrigir, surgiu no final da década de 70 o colágeno bovino injetável30, comercialmente conhecido como Zyderm® (Figura 4), produzido em Santa Bárbara, Califórnia.

Figura 4. Colágeno bovino injetável encontrado comercialmente30.

Em uma recente história poucos produtos médicos tem estimulado maior interesse que o colágeno bovino injetável. Entretanto, em 1981 após 6,5 anos dos primeiros resultados médicos apresentados com produto, o FDA aprovou o seu primeiro agente injetável xenogênico para aumento de tecido mole31. Segundo a Sociedade Americana de Cirurgia Plástica, desde a sua liberação, mais de 5.000.000 de pacientes em mais de 28 países do mundo, receberam o implante de colágeno bovino injetável, sendo sua eficácia comprovada em mais de 280 estudos clínicos publicados na literatura internacional32.
Há três tipos de produtos injetáveis derivados de colágeno bovino no mercado, onde cada tipo é adequado a uma função específica: Zyderm I, Zyderm II, e Zyplast (produzidos pela Inamed Aesthetics, Santa Bárbara/CA). Zyderm I, aprovado em 1981 pelo FDA é composto de colágeno bovino na concentração de 3,5%, suspenso em tampão fosfato de sódio fisiológico e 0,3% de lidocaína. Zyderm II difere do Zyderm I por conter 6,5% de colágeno bovino e foi aprovado pelo FDA em 1983. Zyplast, aprovado pelo FDA em 1985, contém 3,5% colágeno de bovino reticulado com 0,0075% glutaraldeído na qual fortalece as fibras de colágeno e estende a duração da ação enzimática. Cada um destes produtos contém 95% de colágeno do tipo I e 5% tipo colágeno de III. Todos os três produtos são comercializados em serigas de 0,5–1,5mL com custo médio de 398 dólares4.
Zyderm I e II são usados para correção de linhas superficiais da pele incluindo as glabelares, que são comuns em pessoas mais sérias, sulcos entre as sobrancelhas, linhas horizontais da fronte, “pés de galinha”, linhas periorais finas e cicatrizes de acne33. Devido a maior concentração de colágeno, o Zyderm II é mais efetivo para correção de rugas mais profundas. Por outor lado, o Zyplast proporciona um melhor resultado no tratamento de linhas mais profundas como as dobras nasolabiais33.
Em virtude da degradação por colagenase34, a correção cosmética com colágeno de origem bovina normalmente duram aproximadamente 3 meses. Porém, há relatos de duração de até 18 meses35. Devido a reticulação com glutaraldeído, Zyplast é conhecido por durar muito mais tempo que Zyderm33. Além disso, a quantidade do preenchimento, área de tratamento, e técnicas de injeção são fatores importantes dentro da longevidade da correção.
Há possibilidade de paciente tratados com colágeno bovino desenvolverem reações alérgicas ao material estranho. De modo geral 1,5 à 3% dos pacientes apresentam este tipo de reação36. Para evitar as reações colaterais antes de sua utilização, o paciente precisa ser submetido a testes de sensibilidade. Um deles é feito na lateral do braço ou na periferia da face, de quinze a trinta dias após o primeiro com 0,3mL do material37. No caso do paciente ser alérgico ao colágeno, dois dias após o teste as reações aparecem na forma de uma pequena lesão papulosa, puriginosa e avermelhada no local onde o material foi aplicado. Raramente pode acontecer uma reação alérgica depois de quatro semanas. Se a pessoa fez os testes e não houve reação alérgica, pode iniciar o tratamento. Deve-se lembrar que nem todo mundo pode fazer o implante de colágeno. Para quem tem alergias ou doenças auto-imunes, como lupus eritematoso e artrite reumatóide, o tratamento é contra-indicado36. Isso porque, quando a pessoa produz excesso de anticorpos, a injeção de uma substância de origem bovina pode aumentar esse tipo de reação no organismo. No caso de hipersensibilidade prévia ao colágeno bovino, sensibilidade à lidocaína ou um episódio anafilactóide, esse método também não pode ser usado36.

I.2.1. Características dos géis injetáveis de colágeno

Estes géis inicialmente eram formados por uma dispersão microfibrilar de colágeno em tampão fosfato a pH 7,2 preparado a partir da precipitação controlada de microfibrilas a partir de colágeno solúvel pepsinado, em uma concentração final de 35 mg de colágeno por mililitro. Recentemente, preparações comerciais de géis injetáveis de colágeno com concentrações de 65 mg/mL (Ziderm II) tem sido desenvolvidas, e vem mostrando ser mais eficiente na produção adequada da elevação e persistência do seu volume com relação ao 35mg/mL já existentes33.
No entanto, a produção destes géis exige um rígido controle de qualidade em todas as etapas, desde a extração até a operação de formação das fibrilas, as quais devem possuir uma faixa restrita de tamanho, aproximadamente 90% do total das fibras devem possuir diâmetros inferiores a 10mm38. Isto porque, para um bom desempenho técnico e funcional, é necessário que ao ser injetado o material tenha um comportamento de um fluido viscoso, e que apresente no local de aplicação um comportamento semelhante a de um sólido elástico. Este por sua vez, deve permanecer no sítio sem solubilização por longo tempo, e responder aos esforços mecânicos de maneira similar ao tecido nas vizinhanças.

I.2.2. A estabilização dos géis de colágeno injetável

Um aspecto importante na aplicação do colágeno injetável é a persistência do implante. Em muitos casos, o implante deve resistir à degradação o tempo suficiente para que se processe a regeneração do tecido, evitando a necessidade de sucessivas aplicações. Em vista disso, tem sido utilizado nas preparações comerciais o glutaraldeído (1,5-pentanodial), um aldeído bidentado que interliga covalentemente grupos e-amino de lisina e hidroxilisina de cadeias laterais adjacentes por meio de ligações do tipo base de Schiff. Esta reticulação no caso dos géis injetáveis é realizada com concentrações tão baixas como 0,0075%. Por sua vez, estas preparações são caracterizadas por efeitos citotóxico localizados39 e pela precipitação de fibras na agulha dificultando seu escoamento, comprometendo a eficiência da correção pretendida.
Para minimizar esses problemas, algumas alternativas tem sido propostas. Uma delas consiste na filtração dessas dispersões, utilizando telas de aço como meio filtrante40. Este método embora reduza a incidência de obstruções na agulha durante a extrusão do gel, tem o inconveniente do custo do processo. Outra alternativa é o uso de glicosaminoglicanas (GAG) na preparação de colágeno injetável41. Esses polissacarídeos aniônicos de alta massa molecular presentes na matriz extracelular do tecido conjuntivo juntamente com o colágeno e a elastina tem um papel importante na fibrilogênese do colágeno, regulando a cinética de formação das fibras e seu tamanho.
No caso, o ácido hialurônico (AH) (Figura 5), quando adicionado à suspensão de colágeno reticulado na concentração de 5 mg/mL, facilita significativamente o escoamento do gel. Testes reológicos dessas misturas demonstraram que a presença de AH reduz a força necessária para se realizar a deformação e escoamento do material, evitando associação entre as fibras por um mecanismo de repulsão eletrostática42. Apesar dos resultados favoráveis, o uso comercial de GAG é limitado devido à dificuldade na sua extração, posterior purificação e portanto o custo final da preparação43.

Figura 5. Estrutura do Ácido Hialurônico (AH).

Uma terceira alternativa é a utilização de colágeno aniônico associada ao polímero de origem bacteriana, a ramsana44 (Figura 6), com a expectativa de obter géis de colágeno mais estáveis e com baixa capacidade de fibrilogênese em virtude da repulsão eletrostática. A aplicação destes polímeros na área de biomateriais, principalmente na produção de biomaterias injetáveis é recente, tendo início no grupo de Bioquímica e Biomateriais do Instituto de Química de São Carlos. O uso deste polissacarídeo para confecção de biomateriais foi motivado pelo seu histórico na área petroquímica, principalmente na perfuração de poços de petróleo onde é utilizado como agente lubrificante. Assim como esperado, quando associou-se ao colágeno para obtenção de géis injetáveis para correções plásticas em geral, ele apresentou boas características de injetabilidade e recuperação quando submetidos a tensões relativamente altas9. Surpreendentemente, mostrou-se ser altamente biocompatível e eficiente na produção adequada da elevação e persistência do seu volume, em função do crescimento tecidual,  quando injetado na submucosa vesical de coelho para correção do refluxo urinário45. Dessa forma, tem conseguido evitar o uso do glutaraldeído encontrado nas preparações comerciais para estabilização destes géis, minimizando além da citotoxicidade localizada.

Figura 6. Estrutura primária de uma das cadeias da dupla hélice da ramsana46.

3. Conclusão
Muitos dos defeitos cutâneos associados com o envelhecimento, foram descobertos por serem causados pela perda e diminuição de colágeno. Desta forma, é compreensível porque até os dias de hoje o colágeno é um popular preenchedor para correção de defeitos de tecidos moles. Em parte, isto tem mudado, pois enquanto ele foi utilizado como um agente solitário quando chegou ao mercado, hoje ele é utilizado em combinação com outros agentes preenchedores de longa duração. Por isso, quando estiver decidindo sobre qual agente preenchedor utilizar, muita atenção deverá ser dada a seleção do paciente, localização anatômica do defeito a ser tratado e a longevidade do produto. Deve-se lembrar que milagres não existem, temos limitações impostas pelo organismo e pelas técnicas existentes, por isso, precisamos conhecê-las e respeitá-las. No entanto, cabe a você e ao seu médico planejarem juntos a terapia e o material mais eficaz para o seu tipo de problema.

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